人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒工作原理

实验原理：
人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。用纯化的人促甲状腺素释放激素(TRH)抗体包被微孔板
，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促甲状腺素释放激素(TRH)
，再与HRP标记的促甲状腺素释放激素(TRH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物






，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色

，并在酸的作用下转化成最终的黄色


。颜色的深浅和样品中的促甲状腺素释放激素(TRH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)
，通过标准曲线计算样品中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一
、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一



、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔

、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔
，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl




，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五
、第六孔中


，再在第五
、第六孔中分别加标准品稀释液50ul

，混匀



；混匀后从第五
、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中
，再在第七

、第八孔中分别加标准品稀释液50μl
，混匀后从第七

、第八孔中分别取50μl加到第九


、第十孔中
，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉
。(稀释后各孔加样量都为50μl


，浓度分别为180U/mL, 120U/mL , 60U/mL, 30U/mL,15 U/mL)



。
2. 加样


：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂

，其余各步操作相同)
、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)





。加样将样品加于酶标板孔底部
，尽量不触及孔壁
，轻轻晃动混匀



。
3. 温育

：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液
：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用

。
5. 洗涤




：小心揭掉封板膜
，弃去液体


，甩干
，每孔加满洗涤液

，静置30秒后弃去





，如此重复5次


，拍干
。
6. 加酶
：每孔加入酶标试剂50μl



，空白孔除外



。
7. 温育


：操作同3

。
8. 洗涤
：操作同5

。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀
，37℃避光显色15分钟.
10. 终止
：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)


。
11. 测定

：以空白空调零
，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行
。