人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒工作原理

实验原理：
人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。用纯化的人促甲状腺素释放激素(TRH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促甲状腺素释放激素(TRH)
，再与HRP标记的促甲状腺素释放激素(TRH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物
，经过彻底洗涤后加底物TMB显色
。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色




。颜色的深浅和样品中的促甲状腺素释放激素(TRH)呈正相关

。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平
。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样
：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl



，然后在第一
、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀
；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔
，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl

，混匀
；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉
，再各取50μl分别加到第五
、第六孔中


，再在第五


、第六孔中分别加标准品稀释液50ul



，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七




、第八孔中
，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl
，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中




，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl

，浓度分别为180U/mL, 120U/mL , 60U/mL, 30U/mL,15 U/mL)
。
2. 加样
：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂

，其余各步操作相同)


、待测样品孔



。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl
，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)
。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育
：用封板膜封板后置37℃温育30分钟
。
4. 配液

：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用
。
5. 洗涤



：小心揭掉封板膜，弃去液体
，甩干

，每孔加满洗涤液
，静置30秒后弃去，如此重复5次

，拍干。
6. 加酶
：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育
：操作同3
。
8. 洗涤
：操作同5

。
9. 显色




：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀

，37℃避光显色15分钟.
10. 终止

：每孔加终止液50μl

，终止反应(此时蓝色立转黄色)

。
11. 测定

：以空白空调零





，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行

。