人肥胖抑制素(obestatin)ELISA检测试剂盒说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断
人(Human)肥胖抑制素(obestatin)ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA) 。往预先包被肥胖抑制素(obestatin)抗体的包被微孔中 ，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体 ，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色 ，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色 。颜色的深浅和样品中的肥胖抑制素(obestatin)呈正相关 。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度 。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清 ：使用不含热原和内毒素的试管 ，操作过程中避免任何细胞刺激 ，收集血液后 ，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离 。
2. 血浆 ：EDTA 、柠檬酸盐或肝素抗凝 。3000 转离心30 分钟取上清 。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物 。
4. 组织匀浆 ：将组织加入适量生理盐水捣碎 。3000 转离心10 分钟取上清 。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测 ，请按一次用量分装 ，冻存于-20℃，避免反复冻融 ，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻 。
自备物品
1. 酶标仪(450nm)
2. 高精度加样器及枪头 ：0.5-10uL、2-20uL 、20-200uL 、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在2-8℃ ，使用前室温平衡20 分钟 。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶 ，这属于正常现象 ，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中 ，密封(低温干燥)保存。
3. 浓度为0 的S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5 倍 ，最终结果乘以5 才是样本实际浓度 。
4. 严格按照说明书中标明的时间 、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无
标准品0.3mL*6 管0.3mL*6 管无
样本稀释液6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液6mL 3mL 无
封板膜2 张2 张无
说明书1 份1 份无
自封袋1 个1 个无
注 ：标准品(S0-S5)浓度依次为 ：0 、30 、60 、120、240 、480 pg/mL
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释 ：蒸馏水按1 ：20 稀释 ，即1 份的20×洗涤缓冲液加19 份的蒸馏水 。
洗板方法
1. 手工洗板 ：甩尽孔内液体 ，每孔加满洗涤液 ，静置1min 后甩尽孔内液体 ，在吸水纸上拍干 ，如此洗板5 次 。
2. 自动洗板机 ：每孔注入洗液350μL，浸泡1min ，洗板5 次 。
操作步骤
1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL ；
3. 样本孔先加待测样本10μL ，再加样本稀释液40μL ；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL ，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干 ，每孔加满洗涤液 ，静置1min ，甩去洗涤液 ，吸水纸上拍干 ，如此重复洗板5 次(也可用洗板机洗板)。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min 。7. 每孔加入终止液50μL，15min 内 ，在450nm 波长处测定各孔的OD 值 。
结果判断
绘制标准曲线 ：在Excel 工作表中 ，以标准品浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标 ，绘制出标准品线性回归曲线 ，按曲线方程计算各样本浓度值 。
试剂盒性能
1. 准确性 ：标准品线性回归与预期浓度相关系数R 值，大于等于0.9900 。
2. 灵敏度 ：最低检测浓度小于1.0 pg/mL 。
3. 特异性 ：不与其它可溶性结构类似物交叉反应 。
4. 重复性：板内 、板间变异系数均小于15%。
5. 贮藏 ：2-8℃ ，避光防潮保存 。
6. 有效期 ：6 个月
免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用 ，不得用于临床实验或人体实验 ，否则所产生的一切后果 ，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作 ，后果由实验者承担 。
