人异柠檬酸脱氢酶(ICD)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒仅供体外研究使用



、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定人血清
、血浆或其它相关生物液体中ICD含量

。

实验原理
用纯化的ICD抗体包被微孔板
，制成固相载体


，往微孔中依次加入标本或标准品


、生物素化的ICD抗体
、HRP标记的亲和素
，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色


，并在酸的作用下转化成最终的黄色

。颜色的深浅和样品中的ICD呈正相关



。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)

，计算样品浓度
。

试剂盒组成及试剂配制
1、 酶标板





：一块(96孔)
2、 标准品(冻干品)










： 2瓶


，请临用前15分钟内配制


。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50 U/L

，然后做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)



，分别配制成50 U/L

，25 U/L
，12.5 U/L





，6.25 U/L
，3.12 U/L，1.56 U/L
，0.78 U/L
，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制25 U/L标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml )50 U/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中


，混匀即可
，其余浓度以此类推

。
3





、 样品稀释液

：1×20ml。
4、 检测稀释液A
：1×10ml
。
5
、 检测稀释液B

：1×10ml。
6、 检测溶液A



：1×120  /瓶(1:100)
。临用前以检测稀释液A 1:100稀释(如：10  检测溶液A / 990 检测稀释液A)
，充分混匀

，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100 /孔)

，实际配制时应多配制  0.1-0.2ml


。
7、 检测溶液B：1×120  /瓶(1:100)
。临用前以检测稀释液B 1:100稀释
。稀释方法同检测溶液A
。
8
、 底物溶液
：1×10ml/瓶
。
9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶

，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍

。
10
、终止液：1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)
。
11
、覆膜：5张
12


、使用说明书

：1份

自备物品
1
、 酶标仪(建议仪器使用前提前预热)
2、 微量加液器及吸头
，EP管
3
、 蒸馏水或去离子水，滤纸

标本的采集及保存
1

、 血清
：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存

，但应避免反复冻融。
2

、 血浆
：可用EDTA或肝素作为抗凝剂
，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，取上清即可检测
，或将上清置于-20 或-80 保存
，但应避免反复冻融
。
3、 其它生物标本

：请1000 g离心20分钟
，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保    存




，但应避免反复冻融
。
 
注：以上标本均应密封保存
，4 保存应小于1周
，-20 不应超过1个月
，-80 不应超过2个月


；标本溶血会影响最后检测结果
，因此溶血标本不宜进行此项检测

。

操作步骤
实验开始前
，各试剂均应平衡至室温
，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀

，混匀时尽量避免起泡

。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释



，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围

，计算时再乘以相应的稀释倍数


。
1
、 加样
：分别设空白孔
、标准孔



、待测样品孔
。空白孔加样品稀释液 100 
，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部
，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜


，37 温育2小时
。为保证实验结果有效
性
，每次实验请使用新的标准品溶液

。
2

、 弃去液体，甩干


，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 (临用前配制)，酶标板加上覆膜，37 温育1小时
。
3
、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次




，每次浸泡1-2分钟

，大约400 /每孔
，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)

。
4
、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100 ，加上覆膜

，37 温育1小时。
5




、 弃去孔内液体

，甩干





，洗板5次，方法同步骤3。
6
、 每孔加底物溶液90

，酶标板加上覆膜37 避光显色(反应时间控制在15-30分钟
，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)
。
7
、 每孔加终止溶液50 ，终止反应
，此时蓝色立转黄色
。终止液的加入顺序应尽量与底物    液的加入顺序相同
。
8




、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)
。

注


：
1
、 试剂准备

：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染
。
2、 加样



：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大
，将会导致不同的 “预温育”时间



，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性





。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内
。推荐设置复孔进行实验


。
3


、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作
，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态
；同时应严格遵守给定的温育时间和温度


。
4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水
，同时要消除板底残留的液体和手指印
，避免影响最后的酶标仪读数

。
5、 试剂配制
：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底
。标准品

、检测溶液A工作液

、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制
，不能混淆。请精确 配制标准品及工作液，尽量不要微量配制(如吸取检测溶液A时
，一次不要小于10 )，以避免由于不准确稀  释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品


、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。
6


、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如
，每隔10分钟)

，如颜色较深

，请提前加入终止液终止反应
，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7
、 底物：底物请避光保存


，在储存和温育时避免强光直接照射
。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法


：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内
，浸泡1-2分钟
，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体
，在实验台上铺垫几层吸水纸



，酶标板朝下用力拍几次
；根据需要

，重复此过程数次



。
2
、 自动洗板
：如果有自动洗板机
，应在熟练使用后再用到正式实验过程中



。

特异性
    本试剂盒可同时检测重组或天然的人ICD

，且与其它相关蛋白无交叉反应
。

计算
  各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图(七点图)
，如设置复孔
，则 应取其平均值计算

。以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)

，OD值为横坐标(对数坐标)
，在对数坐标纸上绘出标准曲线
。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如 curve expert 1.3
，根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数
；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式
，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度
，再乘以稀释倍数
，即为样品的实际浓度
。

检测范围

：0.78 U/L - 50 U/L
，绘制标准曲线请取用以下浓度值：50 U/L
，25 U/L

，12.5 U/L
，6.25 U/L，3.12 U/L
，1.56 U/L


，0.78 U/L




。

最低检测限

：0.5 U/L

说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染

，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果

。
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度

。请注意在吸取标本 / 标准品
，酶结合物或底物时


，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大






，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果
。
3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃

，具体以标签上的标示为准。
4. 浓洗涤液会有盐析出

，稀释时可在水浴中加温助溶。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质
，此为正常现象


，不会对实验结果造成任何影响。
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处
，请以英文说明书为准



。
7. 所有的样品都应管理好
，按照规定的程序处理样品和检测装置。
8. 有效期
：6个月