植物防卫素/植物抗毒素(PDF)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒 植物防卫素/植物抗毒素(PDF)ELISA试剂盒 仅供体外研究使用
预期应用
ELISA法定量测定植物组织、细胞或其它相关样本中防卫素/植物抗毒素(PDF)含量。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体 ，往包被抗PDF抗体的微孔中依次加入标本或标准品 、生物素化的抗PDF抗体 、HRP标记的亲和素 ，经过彻底洗涤后用底物TMB显色 。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的黄色 。颜色的深浅和样品中的PDF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值) ，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板 ：一块(96孔)
1. 标准品(冻干品) ：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml ，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解 ，其浓度为20 ng/ml ，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释) ，分别稀释成20 ng/ml ，10 ng/ml ，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml ，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml ，临用前15分钟内配制 。
如配制10 ng/ml标准品 ：取0.5ml(不要少于0.5ml)20 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中 ，混匀即可 ，其余浓度以此类推。
2. 样品稀释液 ：1×20ml/瓶。
3. 检测稀释液A：1×10ml/瓶 。
4. 检测稀释液B ：1×10ml/瓶。
5. 检测溶液A：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul) ，实际配制时应多配制0.1-0.2ml 。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制 ，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
6. 检测溶液B ：1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释 。稀释方法同检测溶液A 。
7. 底物溶液：1×10ml/瓶 。
8. 浓洗涤液：1×30ml/瓶 ，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
9. 终止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4) 。
10. 覆膜 ：1×5张
操作步骤
实验开始前，请提前配制好所有试剂 ；试剂或样品稀释时，均需混匀 ，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线 。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围 。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数。
1. 加样 ：分别设空白孔 、标准孔、待测样品孔 。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul ，注意不要有气泡 ，加样将样品加于酶标板孔底部 ，尽量不触及孔壁 ，轻轻晃动混匀 ，酶标板加上盖或覆膜 ，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性 ，每次实验请使用新的标准品溶液 。
2. 弃去液体 ，甩干 ，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制 ，轻轻混匀，在使用前一小时内配制) ，37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干 ，洗板3次 ，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干) 。
4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体 ，甩干，洗板5次 ，每次浸泡1-2分钟 ，350ul/每孔 ，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干) 。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内 ，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止) 。
7. 依序每孔加终止溶液50ul ，终止反应 ，此时蓝色立转黄色 。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同 。为了保证实验结果的准确性 ，底物反应时间到后应尽快加入终止液 。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值) 。 在加终止液后立即进行检测。
注：
1. 每次实验留一孔作为空白调零孔(不同于空白孔) ，该孔不加任何试剂 ，只是最后加底物溶液及2N H2SO4 。测量时先用此孔调OD值至零 。
2. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果 。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。
3. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉 。为防止样品蒸发 ，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，洗板拍干后请立即加入后步试剂 ，应避免微孔干燥掉。
4. 消除板底残留的液体和手指印 ，否则影响OD值 。
5. 在储存和温育时避免强光直接照射 。
6. 未使用完的酶标板或者试剂 ，请于2-8℃保存 。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用 。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。
7. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性 。
洗板方法
手工洗板方法 ：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水
纸，酶标板朝下用力拍几次 ；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟 ，根据需
要 ，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机 ，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的植物防卫素/植物抗毒素(PDF)，且与其它相关蛋白无交叉反应 。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标) ，OD值为纵坐标(普通坐标) ，在半对数坐标纸上绘出标准曲线(推荐使用专业制作曲线软件进行分析 ，如curve expert 1.3)，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度 ，再乘以稀释倍数 ；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式 ，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数 ，即为样品的实际浓度 。
注意事项
1. 洗涤过程非常重要 ，不充分的洗涤易造成假阳性。
2. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。
3. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定 ，计算时请最后乘以稀释倍数 。
5. 在配制标准品 、检测溶液工作液时 ，请以相应的稀释液配制 ，不能混淆 。
6. 底物请避光保存 。
说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中 。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染 ，试剂避免受到微生物的污染 ，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度 。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时 ，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大 ，将会导致不同的 “预孵育”时间 ，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且 ，洗涤不充分将影响试验结果 。
3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃ ，部分试剂保存于2-8℃ ，具体以标签上的标示为准。
4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶 。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质 ，此为正常现象 ，不会对实验结果造成任何影响。
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处 ，请以英文说明书为准 。
7. 所有的样品都应管理好 ，按照规定的程序处理样品和检测装置 。
8. 有效期：6个月
