人血清总补体(CH50)ELISA试剂盒仅供研究使用
实验原理:用纯化的抗体包被微孔板 ，制成固相载体 ，往包被抗CH50抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CH50抗体 、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色 。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的黄色 。颜色的深浅和样品中的CH50呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值) ，计算样品浓度 。
预期应用：ELISA法定量测定人血清 、血浆或其它相关生物液体中CH50含量 。
说明:
1．试剂盒保存 ：-20℃(较长时间不用时) ；2-8℃(频繁使用时)。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出 ，稀释时可在水浴中加温助溶 。
3．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质 ，此为正常现象 ，不会对实验结果造成任何影响。
4．中、英文说明书可能会有不一致之处 ，请以英文说明书为准 。
人血清总补体(CH50)ELISA试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate ) ：一块(96孔) 。
2. 标准品(Standard)：2瓶(冻干品) 。
3. 样品稀释液(Sample Diluent) ：1×20ml/瓶。
4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent) ：1×10ml/瓶 。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。
6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody) ：1×120ul/瓶(1 ：100)
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin) ：1×120ul/瓶(1：100)
8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶 。
9. 浓洗涤液(Wash Buffer) ：1×20ml/瓶 ，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍 。
10. 终止液(Stop Solution) ：1×10ml/瓶(2N H2SO4) 。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 干净的试管和Eppendof管
4. 电热恒温培养箱
5. 系列可调节移液器及吸头 ，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血浆 ：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存 ，但应避免反复冻融 。
2. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟 ，取上清即可检测 ，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本 ：请1000 x g离心20分钟 ，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存 ，但应避免反复冻融 。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测 。
标本的稀释原则 ：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量 ，确定适当的稀释倍数 。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中 ，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶 ，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml ，盖好后静置10分钟以上 ，然后反复颠倒/搓动以助溶解 ，其浓度为100 U/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释100 U/ml，50 U/ml ，25 U/ml，12.5 U/ml ，6.25 U/ml ，3.12 U/ml ，1.56 U/ml ，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/ml，临用前15分钟内配制 。
如配制50 U/ml标准品：取0.5ml(不要少于0.5ml)100 U/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中 ，混匀即可 ，其余浓度以此类推 。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul) ，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul生物素标记抗体加990ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 ：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul) ，实际配制时应多配制0.1-0.2ml 。如10ul辣根过氧化物酶标记亲和素加990ul辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制 ，轻轻混匀 ，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前 ，请提前配置好所有试剂 ，试剂或样品稀释时 ，均需混匀 ，混匀时尽量避免起泡 。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释 ，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔 、标准孔 、待测样品孔 。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部 ，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟 。为保证实验结果有效性 ，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体 ，甩干，不用洗涤 。每孔加生物素标记抗体工作液 100ul(取1ul生物素标记抗体加99ul生物素标记抗体稀释液的比例配制 ，轻轻混匀 ，在使用前一小时内配制) ，37℃,60分钟 。
3. 温育60分钟后 ，弃去孔内液体 ，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟 ，350ul/每孔 ，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100ul，37℃ ，60分钟 。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干 ，洗板5次 ，每次浸泡1-2分钟 ，350ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul ，37℃避光显色(30分钟内 ，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色 ，后3-4孔梯度不明显 ，即可终止) 。
7. 依序每孔加终止溶液50ul ，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同 。为了保证实验结果的准确性 ，底物反应时间到后应尽快加入终止液 。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注 ：
1. 用户在初次使用试剂盒时 ，应将各种试剂管离心数分钟 ，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔 ，该孔不加任何试剂 ，只是最后加底物溶液及2N H2SO4 。测量时先用此孔调OD值至零 。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内 ，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂 ，请于2-8℃保存 。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用 。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液 。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性 。
洗板方法:
1. 自动洗板 ：如果有自动洗板机 ，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
2. 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体 ；在实验台上铺垫几层吸水纸 ，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内 ，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
计算:以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线 ，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式 ，计算出样品浓度 ，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓 ，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性 。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内 ，如标本数量多 ，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线 ，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高 ，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品 、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存 。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂.
9. 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人CH50 ，且与其他相关蛋白无交叉反应。
10. 有效期 ：6个月
