鹿主要组织相容性复合体(MHC)ELISA试剂盒说明书
本试剂盒仅供研究使用
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的鹿MHC ，且与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期 ：6个月
预期应用 ：ELISA法定量测定鹿血清 、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中MHC含量。
说明
1．试剂盒保存 ：-20℃(较长时间不用时) ；2-8℃(频繁使用时) 。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶 。
3．中 、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象 ，不会对实验结果造成任何影响 。
概述
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC) ，又称主组织相容性复合基因 ，是存在于大部分脊椎动物基因组中的一个基因家族 ，与免疫系统密切相关 。共分成两类 ：第一型：MHC class I(MHC I)位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况 ，比如该细胞遭受病毒感染，则相病毒外膜碎片的氨基酸链透过MHC 提示在细胞外侧，可以供杀手T细胞等辨识，以进行扑杀 。
第二型 ：MHC class II(MHC II)只位于抗原提示细胞上 ，如巨噬细胞等 。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入 ，则巨噬细胞进行吞食后 ，把细菌碎片利用MHC提示给辅助T细胞 ，启动免疫反应 。
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗MHC抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MHC抗体 、HRP标记的亲和素 ，经过彻底洗涤后用底物TMB显色 。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的黄色 。颜色的深浅和样品中的MHC呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值) ，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板(Assay plate ) ：一块(96孔) 。
2. 标准品(Standard) ：2瓶(冻干品) 。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶 。
4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent) ：1×10ml/瓶 。
5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent) ：1×10ml/瓶 。
6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)
7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1 ：100)
8. 底物溶液(TMB Substrate) ：1×10ml/瓶 。
9. 浓洗涤液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10. 终止液(Stop Solution) ：1×10ml/瓶(2N H2SO4) 。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时 ，最好用多通道移液器
6. 蒸馏水 ，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟 ，取上清即可检测 ，或将标本放于-20℃或-80℃保存 ，但应避免反复冻融。
2. 血浆 ：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000 g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存 ，但应避免反复冻融 。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本 ：1000g离心20分钟 ，取上清即可检测 ，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注 ：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测 。
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量 ，确定适当的稀释倍数 。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中 ，应做好详细的记录。最后计算浓度时 ，稀释了“N”倍 ，标本的浓度应再乘以“N” 。
标准品的稀释原则 ：2瓶 ，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50 ng/ml ，做系列倍比稀释后 ，分别稀释50 ng/ml ，25 ng/ml，12.5 ng/ml ，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml ，1.56 ng/ml ，0.78 ng/ml ，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制25 ng/ml标准品 ：取0.5ml(不要少于0.5ml)50 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中 ，混匀即可 ，其余浓度以此类推 。
生物素标记抗体的稀释原则：
临用前以生物素标记抗体稀释液稀释 ，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml 。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀 ，在使用前一小时内配制 。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则 ：
临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释 ，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml 。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制 。
操作步骤
实验开始前 ，请提前配置好所有试剂 ，试剂或样品稀释时，均需混匀 ，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线 。如样品浓度过高时 ，用样品稀释液进行稀释 ，以使样品符合试剂盒的检测范围 。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔 、待测样品孔 。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl ，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁 ，轻轻晃动混匀 ，酶标板加上盖或覆膜 ，37℃反应120分钟 。
为保证实验结果有效性 ，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体 ，甩干 ，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀 ，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体 ，甩干，洗板3次 ，每次浸泡1-2分钟 ，200μl/每孔 ，甩干 。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl，37℃ ，60分钟 。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体 ，甩干，洗板5次 ，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl ，37℃避光显色(30分钟内 ，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色 ，后3-4孔显色不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50μl ，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同 。为了保证实验结果的准确性 ，底物反应时间到后应尽快加入终止液 。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值) 。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟 ，以便试剂集中到管底 。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔 ，该孔不加任何试剂 ，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零 。
3. 为防止样品蒸发 ，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂 ，请于2-8℃保存。标准品 、生物素标记抗体工作液 、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用 。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液 、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定 ，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体 ；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要 ，重复此过程数次 。
自动洗板 ：如果有自动洗板机 ，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标) ，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线 ，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度 ；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数 ，即为样品的实际浓度 。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓 ，避免起泡 。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性 。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内 ，如标本数量多 ，推荐使用排枪加样 。
4. 请每次测定的同时做标准曲线 ，最好做复孔 。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数 。
6. 在配制标准品 、检测溶液工作液时 ，请以相应的稀释液配制，不能混淆 。
7. 底物请避光保存 。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂 。
