人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒工作原理

实验原理：
人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。用纯化的人促甲状腺素释放激素(TRH)抗体包被微孔板

，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促甲状腺素释放激素(TRH)


，再与HRP标记的促甲状腺素释放激素(TRH)抗体结合






，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物
，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色
，并在酸的作用下转化成最终的黄色
。颜色的深浅和样品中的促甲状腺素释放激素(TRH)呈正相关
。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)
，通过标准曲线计算样品中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl

，然后在第一



、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀
；然后从第一孔
、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔
，再在第三


、第四孔分别加标准品稀释液50μl
，混匀
；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉

，再各取50μl分别加到第五




、第六孔中

，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul
，混匀
；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中
，再在第七

、第八孔中分别加标准品稀释液50μl


，混匀后从第七
、第八孔中分别取50μl加到第九


、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉
。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180U/mL, 120U/mL , 60U/mL, 30U/mL,15 U/mL)
。
2. 加样
：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂







，其余各步操作相同)、待测样品孔




。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)
。加样将样品加于酶标板孔底部
，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟
。
4. 配液

：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用

。
5. 洗涤



：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去
，如此重复5次，拍干


。
6. 加酶



：每孔加入酶标试剂50μl
，空白孔除外。
7. 温育
：操作同3
。
8. 洗涤
：操作同5
。
9. 显色
：每孔先加入显色剂A50μl
，再加入显色剂B50μl
，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止
：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)
。
11. 测定


：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)
。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。